A implantação dos cursos de pós-graduação stricto sensu na Esalq, em 1964, decorreu da necessidade de aperfeiçoamento do seu corpo docente e do desenvolvimento de seus programas de pesquisa. Essa iniciativa, além de representar uma antecipação aos dispositivos legais emanados do Conselho Federal de Educação em 1965 e 1969 foi pioneira no âmbito da USP, onde a implantação formal da pós-graduação ocorreu em 1969.

Em maio de 1964, a Congregação da Escola cuidou da constituição do Conselho Diretor dos Cursos Pós-Graduados, que teve por presidente seu diretor à época, Prof. Eurípedes Malavolta, além de seis membros, docentes catedráticos, a saber: Izaias Rangel Nogueira, da 16ª Cadeira (Experimentação e Estatística), Ferdinando Galli, da 11ª (Fitopatologia), Friedrich Gustav Brieger, da 19ª (Genética e Melhoramento de Plantas), Anivaldo Pedro Cobra, da 15ª (Mecânica, Motores e Máquinas Agrícolas), o próprio E. Malavolta, da 20ª (Nutrição de Plantas), e Guido Ranzani, da 13ª (Solos).

Em 15 de setembro de 1964, foram iniciados, formalmente, seis cursos nas áreas de Experimentação e Estatística (atualmente Estatística e Experimentação Agronômica), Fitopatologia, Genética e Melhoramento de Plantas, Mecânica, Motores e Máquinas Agrícolas (desativado em 1970), Nutrição de Plantas e Solos.

Os cursos tiveram início com 54 alunos, em regimes bienais, com disciplinas trimestrais; de 1966 em diante, passaram a acompanhar o semestre letivo da Esalq. Aos pós-graduados, a USP outorgou o título de Magister Scientiae, sendo a primeira dissertação defendida por Deodato Miguel de Paula Souza, em 16 de janeiro de 1966, aluno do Curso de Pós-Graduação em Solos. Também coube a esse curso a outorga do primeiro título de doutor, a Oscar Eugênio Lopez Gorastiaga, em 30 de março de 1973, portanto sete anos depois.

O primeiro título de Magister Scientiae outorgado a uma mulher ocorreu em 15 de dezembro de 1967, a Carmen Silva Pereira, do Curso de Pós-Graduação em Experimentação e Estatística; Vera Ligia Letízio Machado, do Curso de Pós-Graduação em Entomologia, foi a primeira mulher a obter o título de doutor, em 11 de setembro de 1974.

Ainda nos anos 60, novos cursos foram criados: Ciências Sociais Rurais (1966), Nutrição Animal e Pastagens (1966, atualmente Ciência Animal e Pastagens), Entomologia (1968), Fitotecnia (1968); em 1969, a Esalq foi reconhecida pelo CNPq como "centro de excelência" para o desenvolvimento de pós-graduação e pesquisa em Ciências Agrárias.

Em 1970, os cursos de Fitopatologia, Genética e Melhoramento de Plantas e Solos e Nutrição de Plantas (resultado da união de dois cursos) foram ampliados e passaram a oferecer o doutorado, iniciativa pioneira na América Latina.

Também na década de 70, foram criados o mestrado em Energia Nuclear na Agricultura (1976, desativado na Esalq em 10 de janeiro de 1990 e transferido para o Cena na mesma data), Agrometeorologia (1976), Engenharia Florestal (1976, posteriormente denominado Ciências Florestais), Microbiologia Agrícola (1976), Tecnologia de Alimentos (1977, atualmente Ciência e Tecnologia de Alimentos), Irrigação e Drenagem (1978) e os doutorados em Entomologia (1972) e Estatística e Experimentação Agronômica (1979). Em 1975, o Curso de Ciências Sociais Rurais foi desdobrado em Economia Agrária (atualmente Economia Aplicada) e Sociologia Rural, este desativado em 30 de junho de 1986. Na década de 80, destacou-se a criação dos mestrados em Fisiologia e Bioquímica de Plantas (1988) e em Máquinas Agrícolas (1989) e do doutorado em Fitotecnia (1986).

Posteriormente, foram criados o doutorado em Economia Aplicada (1990), Irrigação e Drenagem (1990), Microbiologia Agrícola (1996), Ciência Animal e Pastagens (1998) e Fisiologia e Bioquímica de Plantas (2003). Os antigos cursos de Ciência e Tecnologia de Madeiras (criado em 1992) e Ciências Florestais foram extintos, dando lugar ao Programa em Recursos Florestais, em 1999. Da mesma forma, em 2001, o Curso de Agrometeorologia foi transformado em Física do Ambiente Agrícola, que passou a oferecer também o doutorado. Nesse mesmo ano, foi criado o Programa Interunidades Ecologia de Agroecossistemas (Esalq/Cena), centrado na temática da ecologia dos sistemas agrícolas, representando uma iniciativa pioneira no País.

De início, a pesquisa vinculada às atividades de pós-graduação na Esalq contou com a colaboração de diversas instituições, como a Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo, o Centro de Tecnologia Copersucar, o Instituto Brasileiro do Café (IBC), o Planalsucar (hoje extinto), além das atuais Fapesp, CNPq, Capes e Finep. Dentre as instituições estrangeiras, a Esalq contou com o apoio da Fundação Rockefeller e Ford, do Instituto Interamericano de Ciências Agrícolas (IICA) e da Ohio State University. O convênio entre a Esalq e esta última, de 1964 a 1980, foi muito estimulado pelos recursos provenientes da Agência para o Desenvolvimento Internacional dos Estados Unidos da América. Membros do corpo docente da FAES/OSU trabalharam na Esalq, atuando como parceiros para aumentar e melhorar a oferta de disciplinas e de programas de pesquisa e para fortalecer as ligações entre os programas de ensino, pesquisa e extensão.